2022年9月14日，國際藥物化學權威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》在線發表了華東師范大學陳益華/易正芳研究員團隊合作的最新研究成果“Discovery of a Novel Potent STAT3 Inhibitor HP590 with Dual p-Tyr705/Ser727 Inhibitory Activity for Gastric Cancer Treatment”。這是繼4月27日陳益華團隊在同期刊發表“Discovery of 2-Amino-3-cyanothiophene Derivatives as Potent STAT3 Inhibitors for the Treatment of Osteosarcoma Growth and Metastasis”后在STAT3抑制劑研究方面取得的又一次重要突破。

圖1.文章標題

近年來，靶向轉錄調控因子已成為開發新型抗腫瘤藥物的熱門研究領域之一。信號傳導及轉錄激活蛋白3（STAT3）是一類重要的轉錄因子，其常被發現在多種癌癥中異常激活，參與腫瘤發生發展的多個過程，并與多種癌癥的不良預后密切相關。因此，在過去二十年，STAT3作為潛在的抗腫瘤靶點受到大量藥物研究科學家和制藥公司的青睞。目前，已有少量直接STAT3抑制劑進入臨床用于不同癌癥治療的研究，但這些抑制劑仍存在體內抗腫瘤效果不足、成藥性較差以及安全性不夠等問題，更重要的是，大部分報道的STAT3抑制劑只能抑制STAT3的Tyr705位點磷酸化，而不能抑制STAT3另一個氨基酸殘基Ser727的磷酸化。大量研究表明，STAT3的激活主要涉及兩個氨基酸殘基Tyr705和Ser727的磷酸化，兩者在腫瘤細胞中發揮不同的生物學功能，Tyr705磷酸化主要介導STAT3的核轉錄功能，而Ser727磷酸化主要介導STAT3的線粒體氧化磷酸化功能，兩者在多種腫瘤中高表達且均能促進腫瘤的惡性增殖或導致其他腫瘤發展過程。鑒于STAT3 Ser727磷酸化在多種腫瘤中同樣發揮著重要作用，陳益華研究員團隊與其合作者易正芳研究員團隊致力于開發能同時抑制Tyr705和Ser727磷酸化的新型STAT3抑制劑。

圖2.STAT3雙磷酸化抑制劑的篩選策略及苗頭化合物1a的發現

本研究中，作者們以STAT3雙位點磷酸化在胃癌細胞發生發展的重要角色為背景，基于STAT3雙位點磷酸化在腫瘤細胞中介導不同生物學功能建立了全新的STAT3雙磷酸化抑制劑的高通量篩選實驗，即表征STAT3 p-Tyr705抑制活性的STAT3依賴性熒光素酶實驗（Luciferase reporter assay）和用于表征p-Ser727抑制活性的ATP抑制實驗 (ATP inhibition assay)。隨后，通過篩選大量化合物，作者獲得一個能在微摩爾水平顯著抑制STAT3熒光素酶活性、胃癌細胞中ATP生成以及多株胃癌細胞增殖的理想苗頭化合物1a（圖2）。為了進一步提高苗頭化合物1a的生物活性，作者們進行了理性的藥物化學設計與構效該系研究，最終導致了具有低納摩爾抗腫瘤活性的先導化合物HP590的發現（圖3）。同時，作者們還在本文中總結了這類三芳香雜環STAT3雙磷酸化抑制劑的構效關系，其具體內容如圖4所示。

圖3.從苗頭化合物到先導化合物的結構優化過程

圖4.改造化合物的構效關系總結

接下來的工作中，作者們對先導化合物HP590進行了系統的靶點驗證和體內外抗腫瘤活性評價。首先，作者們在WB實驗中驗證先導化合物HP590是否能在腫瘤細胞中抑制STAT3的雙位點磷酸化。結果顯示，HP590能在低納摩爾濃度下以時間梯度和濃度梯度依賴的方式抑制多株胃癌細胞中的STAT3雙位點磷酸化，而對STAT3蛋白本身沒有顯著影響。隨后，作者們通過分子對接（docking）、微量熱泳動儀（MST）、細胞熱轉移實驗（CETSA）實驗證明HP590能以高親和性和選擇性的結合到STAT3的SH2結構域，而對與其高度同源的STAT1和STAT5無結合作用。另外，作者們還發現HP590對STAT3上游酪氨酸激酶和絲氨酸激酶無明顯的抑制作用。這些證據表明HP590是一個直接的STAT3抑制劑，其可以通過靶向STAT3的SH2結構域顯著抑制其雙位點磷酸化（圖5）。緊接著，作者們還通過調查HP590對胃癌細胞中STAT3下游、STAT3轉入細胞核以及線粒體氧化磷酸化的抑制效果，結果顯示HP590能同時抑制p-Tyr705和p-Ser727分別介導的核轉錄功能和線粒體氧化磷酸化功能，再次表明HP590是一個STAT3雙位點磷酸化抑制劑。此外，作者還對HP590的藥代動力學性質進行初步的評價，結果顯示HP590具有較優的口服生物利用度以及體內代謝穩定性，同時對多種CYP450酶無明顯抑制作用。

圖5.HP590通過選擇性靶向STAT3抑制其雙位點磷酸化

最后，作者們對HP590的體內外抗胃癌細胞增殖活性進行評價。結果表明，HP590能選擇性抑制胃癌細胞的增殖而對低表達STAT3雙磷酸化的正常細胞無明顯抑制，另外，HP590相比于陽性化合物BBI608能更加顯著的抑制多株胃癌細胞的克隆形成以及誘導胃癌細胞的凋亡(圖6)。同時，作者們還發現HP590對敲低STAT3的胃癌細胞無明顯抑制，再次表明STAT3是HP590在體外發揮抗腫瘤活性的主要靶點（圖6）。體內研究表明，口服HP590顯著抑制MKN45異種模型的增殖，而且通過對HP590治療后的腫瘤組織分析發現，HP590在體內同樣顯著抑制STAT3雙位點磷酸化和下游基因的表達，表明STAT3是HP590在體內發揮抗腫瘤活性的主要靶點（圖7）。重要的是，HP590在治療過程中對小鼠體重和主要器官無明顯影響，表明HP590是一類安全有效的STAT3雙磷酸化抑制劑，可為未來胃癌的治療提供新的可能。

總結:該研究報道了一種全新的STAT3雙磷酸化抑制劑的高通量篩選策略，闡述了從苗頭化合物的發現到先導化合物改造和構效關系研究過程，通過靶點的驗證以及體內外的抗腫瘤活性研究確定HP590可作為一類新型的選擇性STAT3雙位點磷酸化抑制劑，為下一代STAT3抑制劑開發提供新的思路。

圖6.HP590在體外顯著抑制胃癌細胞的增殖

圖7.HP590在體內通過抑制STAT3雙位點磷酸化顯著抑制胃癌細胞的增殖

該文章以華東師范大學陳益華研究員和易正芳研究員為共同通訊作者，華東師范大學博士生何朋和博士生繆穎為共同第一作者，另外，該研究獲得華東師范大學劉明耀教授的大力支持。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.2c00413

“精準藥物”公眾號由暨南大學藥學院張章博士創建。張章博士主要從事：1）小分子靶向抗腫瘤藥物的發現、作用機制和成藥性研究；2）基于化學蛋白質組學的疾病和藥物靶標發現研究。作為主要完成人，團隊開發的4個激酶抑制劑先后轉讓給企業進行后期開發，其中1個已上市（奧雷巴替尼），1個報生產，1個在I期臨床，1個在臨床前研究階段。實驗室具備完善的體內外藥效、機制、成藥性、靶標發現和確證等技術平臺；支撐和推動了多個企業靶向抗腫瘤藥物的發現、成藥性評價、新適應癥和機制等研究。