茶樹嘌呤生物堿主要包括咖啡堿、可可堿和苦茶堿等。苦茶堿（1,3,7,9-四甲基尿酸）是一種天然產物，具有顯著的抗抑郁、鎮靜、催眠等藥理活性，而咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）既是重要茶葉品質成分，又有一些特殊人群對它非常敏感。因此，培育高苦茶堿和/或低咖啡堿的茶樹品種將增加茶的健康益處并促進消費。然而，茶樹咖啡堿與苦茶堿的合成及調控機制尚未充分闡明，相關的優異基因未能得到充分發掘利用。

近期，JCR 園藝學Top1期刊Horticulture Research在線發表了我所茶樹種質資源創新團隊題為“A novel TcS allele conferring the high-theacrine and low-caffeine traits and having potential use in tea plant breeding”（論文1）和“Deeply functional identification of TCS1 alleles provides efficient technical paths for low-caffeine breeding of tea plants”（論文2）的研究論文。

研究人員先通過無苦茶堿‘中茶302’(ZC302)和富含苦茶堿特異資源‘乳源苦茶’(RY)人工雜交構建了超過180個個體的F1群體，后又以其中的高苦茶堿F1單株為父本構建了多個人工雜交群體。研究發現，F1個體的苦茶堿含量與咖啡堿含量呈高度負相關（R2 >0.9），高苦茶堿個體與無苦茶堿個體呈1：1分離。混合分組轉錄組測序、分子標記定位和基因表達分析表明苦茶堿合成酶(TcS)基因是決定高苦茶堿性狀的關鍵候選基因，并通過穩定遺傳轉化煙草進一步明確了TcS的功能。在30份具有廣泛遺傳背景的茶樹資源中，僅8份資源含有TcS基因。體外酶活性測定表明‘RY’中TcS編碼的蛋白酶活性較高，并進一步利用突變實驗證明了第241個氨基酸是TcS的關鍵殘基。與其他資源相比，‘RY’的TcS啟動子存在著234 bp的缺失和271 bp的插入，GUS組織化學分析和雙熒光素酶活測定結果均表明‘乳源苦茶’中的TcS啟動子活性相對較高。基于“TcS啟動子271 bp的插入”開發了一個功能標記，它與‘RY’的F1群體和F2群體中的高苦茶堿個體均共分離。上述研究結果表明，新的TcS等位基因導致‘RY’及其子代形成了高苦茶堿、低咖啡堿性狀。

圖1 高苦茶堿功能標記的開發與驗證

茶樹咖啡堿合酶(TCS1)是咖啡堿生物合成途徑中最關鍵的N-甲基轉移酶（NMT），它催化N-3和N-1的甲基化。參與咖啡堿與可可堿等嘌呤生物堿生物合成的NMTs存在著獨立進化機制，這使得TCS1有著多樣的序列變異。除了先前發現的8種TCS1等位變異外，論文2在673份茶樹種質資源中鑒定出了新的等位基因TCS1h。體外活性分析結果表明，TCS1h同時具有可可堿合酶(TS)和咖啡堿合酶(CS)活性，通過點突變實驗明確除第225位氨基酸殘基外，其第269位氨基酸殘基也決定CS的活性高低。研究發現咖啡堿、苦茶堿等的含量與相應功能基因和等位基因的表達有關，基因表達的有無和水平的高低在很大程度上決定了茶樹中嘌呤生物堿的含量。通過GUS組織化學分析和雙熒光素酶檢測表明TCS1e和TCS1f的啟動子活性明顯較低，并進一步通過缺失突變及點突變實驗確定了一個關鍵的順式作用元件(G-box)。綜合本研究及前期的研究結果，將已發現的9種TCS1等位基因分為三種功能不同的類型（只有TS活性、有TS和CS活性但轉錄水平較低、有TS和CS活性且轉錄水平較高），并在多年的種質創新實踐基礎上提出了低咖啡堿育種的技術路徑(圖2)。

圖2 三種低咖啡堿茶樹育種技術路徑

上述研究結果將有助于深入了解低咖啡性狀和高苦茶堿性狀形成的遺傳基礎，開發的功能標記將加快品種培育的速度，為選育高苦茶堿和/或低咖啡堿茶樹品種提供了理論與技術支撐和優異基因資源。