中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所馬鈴薯遺傳育種與栽培創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和蔬菜分子設(shè)計(jì)育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，對(duì)馬鈴薯單倍型DM的基因組進(jìn)行了全序列組裝，獲得了包含24個(gè)端粒和12個(gè)著絲粒完整序列的馬鈴薯單倍型DM的端粒到端粒（T2T）的基因組完成圖（DM8.1），并在之前馬鈴薯基因組未能完整組裝的高度重復(fù)序列區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)了調(diào)控重要農(nóng)藝性狀的大量串聯(lián)復(fù)制的基因簇。相關(guān)研究成果于近日以The gap-free potato genome assembly reveals large tandem gene clusters of agronomical importance in highly repeated genomic regions為題發(fā)表在Molecular Plant（IF=21.949）上。

      馬鈴薯是僅次于小麥和水稻的世界第三大糧食作物，其同源四倍體遺傳和高度雜合性限制了馬鈴薯遺傳育種研究。高質(zhì)量的參考基因組是馬鈴薯遺傳育種研究的重要基礎(chǔ)。雙單倍體DM1-3 516 R44 (DM)基因組在馬鈴薯基因組學(xué)、遺傳和育種研究中作為參考基因組一直發(fā)揮著重要作用，其基因組版本自最初的DM4.04（PGSC, 2011）開始，歷經(jīng)十年提高到了DM6.1（Pham et al., 2020），但仍然存在161個(gè)gap，端粒和著絲粒結(jié)構(gòu)仍不完整，在這些GAP區(qū)域以及端粒和著絲粒結(jié)構(gòu)隱藏著什么遺傳信息不得而知。隨著三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是高連續(xù)性O(shè)NT超長(zhǎng)測(cè)序和高精度HIFI測(cè)序的結(jié)合，有望克服著絲粒或高重復(fù)區(qū)域組裝困難的問題。Gap-free基因組是基因組組裝的最終目標(biāo)，是深入研究著絲粒、富含轉(zhuǎn)座因子（TE）和重復(fù)片段（segmental duplications，SDs）等序列區(qū)域的獨(dú)特基因和變異（SV）的基礎(chǔ)。目前實(shí)現(xiàn)Gap-free基因組的僅有基因組相對(duì)較小的水稻、擬南芥和西瓜。

      該研究利用Nanopore ONT Ultra-long reads和Hi-C掛載，并結(jié)合多種技術(shù)方法進(jìn)行補(bǔ)洞（gap closing），獲得了包含24個(gè)端粒和12個(gè)著絲粒完整序列的馬鈴薯單倍型DM的T2T基因組完成圖（DM8.1）（圖1）。

圖1. DM8.1基因組完成圖

      研究首先利用ONT ultra-long reads進(jìn)行三代組裝和Hi-C掛載，獲得了基因組大小、完整度和連續(xù)性均顯著優(yōu)于DM6.1的基因組版本preDM8，其contig N50是DM6.1的兩倍。preDM8基因組12條染色體僅含有25個(gè)gap，少于DM6.1的161個(gè)，并且直接獲得了chr05的完整染色體。其次，利用迭代組裝、共線性比較、目標(biāo)序列長(zhǎng)片段擴(kuò)增和HiFi測(cè)序等方法填補(bǔ)了preDM8中的25個(gè)gap（圖2）。其中，在HiFi測(cè)序補(bǔ)洞過程中，基于Gap兩側(cè)5 kb的序列設(shè)計(jì)引物，使用long-PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合HiFi測(cè)序reads和gap兩側(cè)序列進(jìn)行迭代組裝，最終獲得了馬鈴薯DM的gap-free基因組（DM8.1）。

圖2. DM基因組的Gap填補(bǔ)流程

      研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在基因組DM6.1未填補(bǔ)的gap中存在高度串聯(lián)重復(fù)的基因簇，且這些基因調(diào)控馬鈴薯的重要農(nóng)藝性狀，包括patatin、TPS、Cupin、Leucine-rich repeat等基因（圖3A）。其中塊莖儲(chǔ)藏蛋白patatin基因在馬鈴薯基因組中特異性大量擴(kuò)增，且這一擴(kuò)增過程在馬鈴薯物種形成、馴化和育種改良過程中持續(xù)發(fā)生；除拷貝數(shù)大量擴(kuò)增之外，patatin的基因功能同時(shí)受到了強(qiáng)烈的正向選擇；轉(zhuǎn)錄組分析顯示，這些高度擴(kuò)增的patatin基因絕大部分在馬鈴薯塊莖中特異性高表達(dá)（圖3B-E）。基于以上發(fā)現(xiàn)，推測(cè)patatin基因通過劑量擴(kuò)增和功能進(jìn)化在馬鈴薯作物馴化和塊莖形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該發(fā)現(xiàn)同時(shí)也提示了通過調(diào)控單個(gè)或少量關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)/絕對(duì)劑量來進(jìn)行作物改良的潛在可行性。

圖3. DM8.1基因組中串聯(lián)重復(fù)基因簇分析

      該研究成果將促進(jìn)我們對(duì)基因組中高度重復(fù)序列區(qū)域或高重復(fù)結(jié)構(gòu)的重視和認(rèn)識(shí)；DM8.1作為茄科作物中第一個(gè)基因組完成圖，也為其他基因組的完成圖組裝提供了參考；另外，DM8.1完成圖將推動(dòng)馬鈴薯及茄科其他作物遺傳育種研究的快速發(fā)展，具有重要的意義。

      中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所馬鈴薯遺傳育種與栽培創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)的李廣存研究員和蔬菜分子設(shè)計(jì)育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)的程鋒研究員為該論文的共同通訊作者，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所楊曉慧副研究員和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所博士生張令奎為本文第一作者。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所的黃三文研究員對(duì)該研究進(jìn)行了指導(dǎo)。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、山東省良種工程、國(guó)家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程等項(xiàng)目的支持。

論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205222004452