線粒體是細胞的動力來源，影響細胞穩態、增殖、死亡的關鍵信號通路。由于線粒體的動態行為以及與其他細胞器的豐富相互作用，熒光顯微鏡的發展特別推動了線粒體研究。線粒體內膜（inner membrane，IM）向內凹陷形成許多層狀或管狀的內嵴，其間距通常小于100nm，導致傳統熒光顯微鏡無法觀察到其內部精細結構。因此，基于固定樣本的電子顯微鏡技術一直作為捕捉線粒體膜結構的主流工具。近年來，活細胞線粒體納米成像已從原理驗證發展成為一種結構和功能研究的可行方法。其中，受激發射損耗納米顯微鏡（STED）和結構光照明顯微鏡（SIM）已被報道用于活細胞的線粒體內嵴成像。然而，目前線粒體納米結構的可視化大多局限于癌細胞的二維（2D）單色成像，正交策略尚未建立，且STED圖像采集會受到細胞器的光損傷或快速光漂白的影響，很難觀察到原生狀態下的線粒體形態。

北京大學未來技術學院、北大-清華生命科學聯合中心陳知行研究員課題組在Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.雜志上發表了題為“Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain” 的研究論文，并被選為封面文章。該研究報道了一款適用于STED納米顯微鏡的線粒體內嵴染料PK Mito Orange （PKMO），其具有優秀的光穩定性和顯著降低的光毒性，可實現在永生化哺乳動物細胞系、原代細胞和組織中的長時程、超分辨率的線粒體動力學成像，單個線粒體的3D-STED成像，以及多色STED成像（圖1）。

圖1：PKMO標記的HeLa細胞線粒體內嵴、微絲蛋白（SPY650FastAct）和細胞核（SPY505 DNA）的多色活細胞成像圖

該研究利用環辛四烯（COT）偶聯策略降低染料光毒性，同時精確調控光譜使得染料與561nm激發光和775nm STED光完美兼容。PKMO染色后的細胞在STED納米顯微鏡下，可觀察到整個細胞中具有高度有序的層狀內嵴網絡，并以低至50nm的光學分辨率捕獲了單個線粒體內嵴形態和線粒體分裂、融合以及管狀發生等動態過程。PKMO因其溫和的性質和優秀的光穩定性可實現活細胞中單個線粒體的3D STED重建。PKMO除了可應用于癌細胞和永生化的細胞系以外，也可實現對光毒性極為敏感的原代細胞和組織的超分辨成像。PKMO展示了在COS-7、HeLa、U-2 OS細胞系以及原代脂肪細胞、原代神經元、原代胰島組織中的內嵴結構及其動力學過程。

線粒體的雙層膜結構產生了線粒體亞區室，它們有著不同的用途。多色納米顯微鏡技術因其可提供較高的分辨率和更多的時空信息，將取代傳統的生化分析或電子顯微技術成為一個強有力的新型分析手段。如圖2所示，PKMO展示了與線粒體IM與線粒體DNA（mtDNA）、線粒體外膜、crista junction、微管蛋白和內質網的多色超分辨成像。多色活細胞STED成像可以揭示生物分子的不同線粒體定位以及線粒體在全細胞內的互作網絡；可提供與要求更高的免疫電鏡技術相似的信息，且可繪制有關結構和生物分子動力學的更多信息。

圖2：線粒體內嵴與mtDNA、線粒體外膜、cristajunction、內質網、細胞骨架的多色STED成像

內嵴結構的缺陷與細胞呼吸功能障礙有關，并與神經退行性疾病或心臟病有關。作者還展示了不同線粒體蛋白缺陷型的細胞系與野生細胞系的內嵴形態的差異。在未來，利用PKMO對活細胞進行超分辨成像有望取代傳統耗時費力的電鏡制樣，成為線粒體結構功能研究的日常工具。

綜上，作者團隊報道了一種兼容活細胞STED成像的、高亮度、低光毒性的新型線粒體探針。PKMO可在永生化的哺乳動物細胞系、原代細胞或組織中實現長時間、超分辨率的內膜動力學記錄。PKMO的光穩定性和光毒性為活細胞線粒體的3D STED顯微鏡成像打開了大門。同時，PKMO可兼容綠色和遠紅熒光標記物，實現多色超分辨率下的線粒體亞結構的多組分分析。多色STED顯微鏡可在100nm分辨率下捕獲線粒體與不同細胞成分的相互作用，BAX誘導的細胞凋亡過程，以及轉基因細胞中的內嵴表型。因此，這項工作提供了一個多功能的工具，用于以多路復用的方式研究線粒體內膜結構和動力學。