北京時(shí)間2022年11月10日凌晨0時(shí)，北京大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤轉(zhuǎn)化研究中心張寧團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）張澤民團(tuán)隊(duì)、北京大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科朱繼業(yè)團(tuán)隊(duì)緊密合作，在Nature發(fā)表了題為“Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”的研究論文。

 

該研究首次在單細(xì)胞精度定義了肝癌的五種免疫微環(huán)境亞型，并命名為TIMELASER分型系統(tǒng)，首次全面揭示腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TAN)的異質(zhì)性，驗(yàn)證CCL4+、PD-L1+ TAN兩個(gè)關(guān)鍵亞群的促腫瘤機(jī)制，最終通過構(gòu)建小鼠肝癌模型， 從In vitro， Ex vivo， In vivo三個(gè)層面，逐步深入地證明靶向腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞有望形成新的肝癌免疫治療方案，這些成果為肝癌的基礎(chǔ)研究和臨床診療提供了關(guān)鍵信息。

 

 

免疫微環(huán)境的異質(zhì)性是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和預(yù)后差的重要原因之一。近年來(lái)，免疫治療及聯(lián)合治療給晚期腫瘤患者帶來(lái)希望，系統(tǒng)探究腫瘤免疫微環(huán)境的異質(zhì)性對(duì)于治療選擇、療效預(yù)測(cè)、方案優(yōu)化及開發(fā)新的免疫治療靶點(diǎn)等有重要指導(dǎo)作用。北京大學(xué)第一醫(yī)院張寧團(tuán)隊(duì)近年來(lái)一直聚焦于肝癌異質(zhì)性探究，通過一系列前期工作揭示了肝癌的基因組異質(zhì)性（Gastroenterology， 2016）、表型異質(zhì)性（Cancer Cell， 2019）和單細(xì)胞拷貝數(shù)異質(zhì)性（Gastroenterology， 2022）。然而，目前對(duì)肝癌免疫微環(huán)境的異質(zhì)性仍缺乏系統(tǒng)深入的探索。

 

以往研究主要基于病理分析或Bulk轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，其結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確解析其細(xì)胞組成且容易忽略含量較少的關(guān)鍵細(xì)胞亞群。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了腫瘤免疫領(lǐng)域的探索，目前多項(xiàng)研究已對(duì)肝癌進(jìn)行了單細(xì)胞水平的探究。然而，這些研究大多關(guān)注特定類型細(xì)胞，其結(jié)果無(wú)法反映免疫微環(huán)境的全部特征。因此，亟需無(wú)偏差的、包含所有細(xì)胞亞型的研究策略以系統(tǒng)揭示肝癌免疫微環(huán)境的異質(zhì)性。

 

為了揭示肝癌腫瘤微環(huán)境特征，研究人員完成了人和小鼠共189個(gè)樣本的無(wú)抗體富集的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖1）。同時(shí)，研究人員對(duì)配套病例進(jìn)行了外顯子測(cè)序，并收集已發(fā)表的8個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)集、453個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和10個(gè)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證分析，并綜合利用腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建In vitro培養(yǎng)體系，基于臨床樣本構(gòu)建Ex vivo實(shí)驗(yàn)體系，基于小鼠腫瘤模型的In vivo實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行功能驗(yàn)證。

 

圖1 本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞亞群

 

肝癌的五種免疫微環(huán)境亞型

 

首先，研究人員系統(tǒng)解析出肝癌免疫微環(huán)境的89個(gè)細(xì)胞亞群。通過層次聚類分析，研究人員成功解析出5種不同的免疫微環(huán)境亞型，其中包含，①免疫激活型TIME-IA (Immune Activation)；②髓系富集免疫抑制型TIME-ISM (Immune Suppressive Myeloid)；③基質(zhì)富集免疫抑制型TIME-ISS (Immune Suppressive Stromal)；④免疫排斥型Immune Exclusion (TIME-IE)；⑤免疫駐留型(Immune Residence)，組合起來(lái)稱之為TIMELASER分型系統(tǒng)（圖2）。隨后，研究人員對(duì)這五種免疫微環(huán)境亞型進(jìn)行了多維度的分析，通過大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證五種亞型的存在；通過空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和CODEX多色免疫技術(shù)揭示五種亞型的細(xì)胞空間分布；通過受體配體分析發(fā)現(xiàn)每種亞型均存在不同的趨化因子受體-配體網(wǎng)絡(luò)，提示了不同亞型的形成機(jī)制；聯(lián)合外顯子數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)不同的亞型富集不同的驅(qū)動(dòng)基因突變，如TP53， CTNNB1， KRAS和IDH1，并發(fā)現(xiàn)不同的亞型富集不同的腫瘤細(xì)胞基因模組。這五種免疫微環(huán)境的發(fā)現(xiàn)為腫瘤免疫治療提供了重要的參考信息。

 

圖2 腫瘤免疫微環(huán)境的5種亞型（TIMELASER）示意圖

 

腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的功能異質(zhì)性

 

中性粒細(xì)胞是一類非常脆弱的細(xì)胞，通常認(rèn)為其在體內(nèi)進(jìn)入外周血后存活不超過一周，體外存活不超過24小時(shí)。因此，先前的肝癌單細(xì)胞研究均未捕獲到這一群細(xì)胞。得益于快速實(shí)驗(yàn)流程和無(wú)抗體富集策略，本研究成功捕獲到3萬(wàn)多個(gè)中性粒細(xì)胞。經(jīng)過聚類分析，研究人員共發(fā)現(xiàn)11個(gè)中性粒細(xì)胞亞群，分別富集在外周血、癌旁和腫瘤組織中（圖3），并成功鑒定出6群腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞。隨后，研究人員解析了這些中性粒細(xì)胞亞群的發(fā)育軌跡和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并發(fā)現(xiàn)兩個(gè)中性粒細(xì)胞亞群CCL4+ TAN和PD-L1+ TAN可能通過不同的機(jī)制促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，研究人員分別構(gòu)建肝癌細(xì)胞系-中性粒細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系（In vitro）和肝癌病人的中性粒細(xì)胞離體分析體系（Ex vivo），通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、ATAC-seq和多色免疫熒光等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CCL4+ TAN通過招募腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而PD-L1+ TAN通過抑制CD8+ T細(xì)胞的殺傷功能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

 

圖3 中性粒細(xì)胞亞群的組織分布和發(fā)育軌跡

 

構(gòu)建小鼠肝癌模型，揭示其中性粒細(xì)胞亞群與人高度保守，并證實(shí)去除中性粒細(xì)胞可以延緩腫瘤生長(zhǎng)

 

為了進(jìn)一步在體內(nèi)探索中性粒細(xì)胞的促腫瘤機(jī)制，研究人員基于Alb-cre/Trp53fl/fl肝臟特異敲除小鼠和肝癌驅(qū)動(dòng)突變構(gòu)建兩種小鼠肝癌自發(fā)腫瘤模型（Myc-？90Ctnnb1， pTMC；Myc-KrasG12D， pTMK），并對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析。研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠的中性粒細(xì)胞亞群與人類高度保守，這一結(jié)果說(shuō)明利用小鼠肝癌模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可為人類肝癌治療提供重要參考信息。隨后，研究人員利用Anti-Ly6G抗體在小鼠模型進(jìn)行中性粒細(xì)胞去除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示治療后，小鼠肝癌生長(zhǎng)得到了有效遏制（圖4）。進(jìn)一步，研究人員還揭示了治療過程中小鼠骨髓、外周血、癌旁和腫瘤組織的中性粒細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化。這些結(jié)果提示開發(fā)基于中性粒細(xì)胞的免疫治療靶點(diǎn)有望形成新的肝癌治療策略。

 

圖4 Anti-Ly6G抗體去除中性粒細(xì)胞可以有效緩解小鼠肝癌生長(zhǎng)

 

綜上，本研究系統(tǒng)揭示了肝癌的免疫微環(huán)境亞型，并深入解析了腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的功能異質(zhì)性，最終通過小鼠肝癌模型證明靶向腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞有望形成新的肝癌免疫治療策略。研究成果預(yù)示，針對(duì)腫瘤相關(guān)中心粒細(xì)胞的干預(yù)，有望大幅增加免疫檢查點(diǎn)有效治療的患者人群，這些成果為肝癌乃至實(shí)體瘤的基礎(chǔ)研究和臨床診療提供了關(guān)鍵信息。

 

北京大學(xué)第一醫(yī)院薛瑞棟副研究員、北京大學(xué)BIOPIC張啟明博士、北京大學(xué)第一醫(yī)院博士研究生曹奇、北京大學(xué)第一醫(yī)院孔瑞瑞副研究員和北京大學(xué)人民醫(yī)院向驍博士為該論文的并列第一作者。北京大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤轉(zhuǎn)化中心張寧教授、北京大學(xué)BIOPIC張澤民教授和北京大學(xué)人民醫(yī)院朱繼業(yè)教授為共同通訊作者。

 

該研究得到國(guó)家自然基金、“十三五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、基礎(chǔ)科學(xué)中心等多項(xiàng)國(guó)家科學(xué)基金的支持和資助。

 

原始出處：

Xue， R.， Zhang， Q.， Cao， Q. et al. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature (2022). https：//doi.org/10.1038/s41586-022-05400-x.